De actie vindt plaats in 1568 in Spanje, in het dertiende regeringsjaar van koning Filips II. De plot is gebaseerd op de relatie tussen Philip II, zijn zoon Don Carlos, erfgenaam van de Spaanse troon, en zijn vrouw, koningin Elizabeth.
In Arrangius, de residentie van de Spaanse koning bij Madrid, ligt de hele Spaanse binnenplaats. Hier is de koningszoon - don Carlos. De koning is koud voor hem, hij is bezig met openbare aangelegenheden en zijn jonge vrouw, die vroeger de bruid van Don Carlos was. Filips II wees zijn bedienden aan zijn zoon om hem te bespioneren.
The Marquise Pose, een jeugdvriend van de prins, komt naar Arrangus uit Vlaanderen, met wie hij ontroerende herinneringen heeft. De infante onthult hem in een criminele liefde voor zijn stiefmoeder, en de markies regelt voor Don Carlos een privé-ontmoeting met Elizabeth. Als reactie op de hartstochtelijke bekentenissen van de prins vraagt ze hem zijn liefde te sturen naar het ongelukkige Spaanse koninkrijk en stuurt hem verschillende brieven met 'tranen van Nederland'.
Na het lezen van deze brieven besluit Don Carlos zijn vader te vragen hem tot gouverneur van Nederland te benoemen, in plaats van de wrede hertog van Alba, die in deze functie zou moeten zitten. Deze intentie is ook in het voordeel van de Markies van Pose.
Het hof van de koning verhuist naar het koninklijk paleis in Madrid. Met moeite zoekt Don Carlos een audiëntie bij Philip. Hij vraagt om naar Vlaanderen gestuurd te worden, waar hij belooft de opstand in Brabant te pacificeren. De koning weigert, hij gelooft dat de prins aan het hof is en de hertog van Alba zal naar Vlaanderen gaan.
Don Carlos is teleurgesteld, op dit moment geeft de pagina van de koningin hem in het geheim een liefdesbriefje waarin hem wordt gevraagd om uit te gaan met de helft van Elizabeth. De prins is er zeker van dat het briefje van de koningin is, hij komt naar de aangegeven plaats en ontmoet de bruidsmeisje Elizabeth, prinses Eboli. De baby heeft verlies. Eboli verklaart haar zijn liefde voor haar, ze zoekt bescherming bij hem tegen aantasting van haar eigen onschuld en geeft de prins een bewijsbrief. Don Carlos begint zijn tragische fout nauwelijks te begrijpen, de prinses, die de onverschilligheid voor haar inziet, vermoedt dat de tekenen van aandacht van het kind, die ze op eigen kosten nam, eigenlijk van de koningin waren. Eboli drijft de prins, maar daarvoor vraagt hij om haar de sleutel terug te geven die Don Carlos op de pagina had gekregen, en de liefdesbrief van de koning aan haar, die ze zojuist aan de prins zelf had gegeven. Don Carlos is getroffen door het nieuws van Philip's houding tegenover prinses Eboli, hij vertrekt, maar neemt de brief mee.
Ondertussen heeft de prins aan het hof van de koning vijanden die de onevenwichtige gezindheid van de troonopvolger niet prettig vinden. De biechtvader van koning Domingo en de hertog van Alba zijn van mening dat een dergelijke vorst zich zeer ongemakkelijk zou voelen op de Spaanse troon. De enige manier om Don Carlos te verwijderen, is door de koning te laten geloven in de liefde van de koningin voor zijn zoon, in dit geval hebben ze volgens Domingo een bondgenoot - prinses Eboli, op wie Philip verliefd is.
Pose is van streek als hij hoort dat de koning weigert een prins naar Vlaanderen te sturen. Don Carlos toont zijn vriend een brief van de koning aan prinses Eboli. De markies waarschuwt de infante voor de intriges van de beledigde prinses, maar beschaamt hem tegelijkertijd omdat hij de gestolen brief wil gebruiken. De pose breekt hem en belooft, als reactie op het lijden van de ongelukkige baby, opnieuw zijn ontmoeting met de koningin te regelen.
Van de hertog van Alba, Domingo en prinses Eboli leert Philip II over Elizabeths "verraad", hij verliest rust en slaap, hij ziet overal complotten. Op zoek naar een eerlijke man die hem zou helpen de waarheid vast te stellen, stopt de blik van de koning bij de markies van houding.
Het gesprek van Philip met de markies doet het meest denken aan een gesprek tussen blinden en doven. Pose beschouwt het als zijn plicht om allereerst een woord te formuleren voor zijn lijdend Vlaanderen, waar de vrijheid van mensen wordt beknot. De oude vorst maakt zich alleen zorgen over persoonlijk welzijn. Philip vraagt de markies om 'vertrouwen te krijgen in zijn zoon', 'om het hart van de koningin te testen' en om zijn trouw aan de troon te bewijzen. weggaand hoopt de nobele overgrootvader nog steeds dat hij vrijheid voor zijn vaderland zal kunnen bereiken.
Als ambassadeur van Philip ontvangt Pose alleen een date met de koningin. Hij vraagt Elizabeth om don Carlos over te halen om zonder de zegen van de koning naar Nederland te gaan. Hij is er zeker van dat de koninklijke zoon in staat zal zijn om "rebellen" onder zijn vlag te verzamelen, en dan zal zijn vader, die het pacified Vlaanderen ziet, hem tot gouverneur van deze provincie aanstellen. De koningin sympathiseert met de patriottische plannen van de Markies van Pose en benoemt Don Carlos tot een date.
De Markies van Pose overhandigt de persoonlijke brieven van Don Carlos aan de koning. Onder hen herkent de vorst het handschrift van het briefje van prinses Eboli, die Elizabeth's verraad aan haar man wilde bewijzen, de kist van de koningin had gehackt en de brieven van don Carlos had gestolen, zoals bleek, zelfs vóór haar huwelijk. De pose vraagt de koning om een stuk papier met zijn handtekening waarmee hij in een extreem geval de onevenwichtige prins zou kunnen arresteren. Philip geeft zo'n document.
Aan het hof is het gedrag van de markies van houding verbijsterend, wat de limiet bereikt wanneer de grote bevelen Don Carlos te arresteren op basis van een brief van de koning. Op dit moment verschijnt postdirecteur Don Raymond de Taxis, hij brengt een brief van Pose, gericht aan de Prins van Oranje, gevestigd in Brussel. Het moet iedereen alles uitleggen.
Prinses Eboli informeert Elizabeth over de arrestatie van het kind en bekent, gekweld door gewetenswroeging, bekent haar wreedheid tegen de koningin en beveelt haar te worden verbannen naar het klooster van St. Mary.
Na een ontmoeting met de koningin, waarin hij Elizabeth vraagt de prins te herinneren aan hun jeugdige eed, gaat de markies Posa de gevangenis in voor haar vriend Don Carlos. Wetende dat dit hun laatste ontmoeting is, onthult hij zijn plan aan de baby. Om Carlos te redden schreef hij een brief aan de Prins van Oranje over zijn denkbeeldige liefde voor de koningin en dat de infante Don Carlos alleen door Philip aan hen werd gegeven om zijn ogen af te wenden. De pose is zeker dat zijn brief in handen van de vorst zal vallen. De prins is geschokt, hij is klaar om naar zijn vader-koning te rennen om vergeving voor zichzelf en de markies te vragen, maar laat: er wordt een schot gehoord, de markies Pose valt en sterft.
In de gevangenis komt Philip om zijn zoon te bevrijden met grandees. Maar in plaats van de dankbare en nederige Don Carlos vindt hij daar een diepbedroefde man die de koning beschuldigt van de dood van een vriend. Er heerst geroezemoes rond de gevangenis; in Madrid begint een opstand van het volk, die de vrijlating van de prins eist.
Op dat moment viel de kartuizermonnik in handen van de spionnen van de hertog van Alba. Hij kreeg brieven van de markies van de pose aan Vlaanderen, waarin hij het had over de vlucht van de kroonprins naar Nederland, waar hij een opstand voor de onafhankelijkheid van dit land zal leiden. De hertog van Alba draagt de brieven onmiddellijk over aan de Spaanse koning.
Koning Philip noemt zichzelf de grootinquisiteur. Hij wordt gekweld door het idee dat kindermoord een ernstige zonde is, terwijl hij besloot van zijn zoon af te komen. Om zijn geweten te sussen, wil de oude vorst de steun van de kerk inroepen voor zijn misdaad. De grote inquisiteur zegt dat de kerk de slachting van zonen kan vergeven en voert het argument aan: "In naam van gerechtigheid werd de eeuwige zoon van God gekruisigd *. Hij is bereid de verantwoordelijkheid op zich te nemen voor de dood van het kind, als de kampioen van de vrijheid niet op de troon zou zitten."
De avond valt, Don Carlos komt op een date met Elizabeth. Hij gaat naar Vlaanderen, vastbesloten in naam van vriendschap om te bereiken waar ze van droomden met de markies. De koningin zegent hem. De koning verschijnt met de grootinquisiteur. De koningin valt flauw en sterft, Philip geeft zonder twijfel zijn zoon in de handen van de grootinquisiteur.