Hal in het Holy Rood Palace. Hij zegt dat de stad rellen heeft. Iemand die hem niet bekend was aan het hoofd van de menigte - mummers, gemaskerd, dansers met bellen, mensen in zwarte kappen - bedreigde, voorspelde en spoorde de mensen aan de koningin niet te gehoorzamen. De hoveling van koningin Riccio bevestigt dat hij ook van tijd tot tijd toekijkt terwijl mensen gretig naar deze preken luisteren. De pagina vertelt verder dat het volk de kapel van de koningin binnenstormde en schreeuwde: "Het nest van de papisten!" Queen Mary Stuart in wanhoop. Ze voelt de haat van de mensen, de meeste hovelingen hebben haar verlaten; ze vraagt zich af hoe haar christendom zo verschillend kan zijn van het christendom van de bevolking van Schotland. Riccio stelt voor om onmiddellijk een decreet op te stellen dat de verantwoordelijken voor de rellen bestraft. Maria dicteert zijn pagina, de pagina verduidelijkt of de naam van Heinrich Darnley, de echtgenoot van de koningin, moet worden ingevoerd. Mary aarzelt; ze vermoedt dat de rellen door hem zijn geïnspireerd - de menigte werd tenslotte geleid door de hansworst van de koning. Hier herinnert Riccio haar eraan dat ze de koningin is; ze is als de zon en ze heeft het recht om van God te straffen. Hij eist onmiddellijk de officier van dienst te bellen om het besluit van de koningin aan te kondigen. Douglas komt binnen. Maria vertelt hem om het papier naar de kanselier Morton te brengen, zodat hij zal stempelen. Douglas scant het decreet en ziet dat het niet de naam van de koning heeft. Hij vraagt de koningin hierover. Riccio is verantwoordelijk voor haar. Douglas verliest zijn geduld. Hij dringt er bij de koningin op aan om geen bloedige onderdrukkingsmaatregelen te nemen, en geeft aan dat hij dit als Franse of Italiaanse invloed ziet. Maar de koningin herinnert hem kil aan haar macht om de onderdanen die ongehoorzaam zijn aan haar wil, te elimineren. Er ontstaat een ruzie tussen Riccio en Douglas, Douglas daagt Riccio uit tot een duel en zweert dat hij de Venetiaan morgen zal vermoorden. De koningin vertrekt en neemt Riccio mee. Douglas wordt met rust gelaten, hij overweegt een duel. Morton komt binnen. Douglas laat hem het decreet zien. Morton is besluiteloos: hij is bang voor de toorn van zowel de koning als de koningin. Zonder te stempelen, biedt Morton de koning aan. Op dit moment was Henry in gesprek met zijn nar Nick, die hem plaagt met het feit dat de koningin echte macht heeft in Schotland, en Henry is alleen haar echtgenoot, dat de koningin naaste kiest, bijvoorbeeld deze Italiaanse harpiste Riccio ... Op dit moment Morton brengt een ongelukkig besluit. Koning van woede, besluit hij Riccio te vermoorden. Koning Lindsay komt het hof binnen, hij roept de koning om te jagen met de nieuw verworven valk. Morton antwoordt dat de koning vandaag al een bezetting heeft. Lindsay sluit zich graag aan bij het complot tegen Riccio. Hij verbiedt letterlijk vanavond Riccio te doden, omdat hij hem morgenochtend moet doden. Vervolgens stuurt Henry, gebruik makend van de vertraging, de nar naar de astroloog om erachter te komen wat de locatie van de sterren is voor zijn bedoelingen.
De astroloog in zijn laboratorium (hij is ook een alchemist) betoogt met zichzelf dat ervaring de zinloosheid van wetenschap bevestigt, dat doel, de wil van de sterren de mens domineert, over goed en kwaad beschikt. Nick komt binnen, besprenkeld met humor, de astroloog doet niet onder voor hem in humor. Nick meldt dat de koning hem heeft gestuurd om te vragen naar het lot van Riccio en vertelt de astroloog de dood van Riccio te voorspellen. De astroloog antwoordt dat de sterren hem zullen vertellen, niet de mensen, en voorspelt op zijn beurt de dood van de nar. Daarmee vertrekt hij. De pagina van de koningin veroorzaakt door de astroloog verschijnt. Page houdt van zijn minnares. De astroloog vertelt hem dat hij de koningin moet vertellen dat vandaag de man van wie ze houdt zal sterven. 'Hoe gaat Botwell vandaag dood?' - roept een pagina uit. De astroloog is verbaasd. Hij had Riccio in gedachten en haast zich om de pagina te waarschuwen. Alleen gelaten vraagt de astroloog zich af - het bleek ook uit de sterren dat Botwell op de een of andere manier donker verbonden was met de koningin - via Mars, Saturnus ... Botwell komt binnen. Uit zijn monoloog blijkt dat hij zich onverwachts in het huis van een astroloog bevond. Botwell realiseert zich waar hij vandaan komt en vraagt de astroloog hoeveel hij nog te leven heeft. De oude man antwoordt dat drie jaar en dat Botwell koning zal zijn. De botwell haalt een fles gif tevoorschijn waarmee hij zelfmoord wilde plegen, wil weggooien - en aarzelt. In de sfeer van paleisintriges komt elk wapen inderdaad van pas. Hij gaat weg.
De pagina vertelt de koningin dat Riccio binnenkort zal komen. De koningin verheugt zich op hem - naar haar mening bleef alleen hij haar trouw. 'En Botvel?' De pagina vraagt. 'Wie is Botvel?' - de koningin is geïnteresseerd. Een verbaasde pagina vertelt Mary hoe, terwijl ze aan het varen was, een sterke wind een roos van het hoofd van de koningin plukte, een bloem in het water viel. En toen snelde een van de hovelingen - Botvel - de boot in en achtervolgde de roeier bang om een roos uit het water te vangen. Nadat ze het verhaal heeft gehoord, stuurt Mary een pagina om te bidden. Ze bekent aan God dat ze geen kracht meer heeft om haar liefde voor Botwell te weerstaan. De koningin weet dat ze aan het hof als verliefd op Riccio wordt beschouwd. Riccio komt binnen. Mary meldt een dodelijk gevaar dat hem bedreigt en neemt koeltjes afscheid van hem, wijzend op het schip dat hem naar Rome zal brengen. Uit wanhoop probeert Riccio de koningin te smeken het besluit om te vertrekken te annuleren. De koningin is onvermurwbaar.
Heinrich, Morton en Lindsay hoorden van Riccio's aanstaande vertrek en overlegden haastig om hem te doden of te laten zeilen. Dan verschijnt Douglas en meldt dat Riccio al heeft gevaren. Douglas wanhopig, hij verlangt naar bloedige wraak, zijn ridderlijke eer is gekwetst. Plots ontmoeten ze een pagina die de koningin een briefje van Riccio brengt - hij is niet weggegaan en zal 's avonds bij haar zijn. De samenzweerders nemen het briefje weg.
Maria borduurt druk in haar kamer. Riccio, die kwam, legt haar uit dat hij niet weg kon, omdat hij 's ochtends een duel heeft met Douglas. Hij geeft toe dat hij zonder haar liefde geen leven nodig heeft. Hij vraagt Mary om hem een rozenkrans te geven - hij zal bloemen planten op het altaar in Rome ... Henry, Douglas en Dindsay komen binnen en doden Riccio. Koningin valt flauw. Douglas wordt getroffen door schaamte en afschuw - hij trekt zich vrijwillig terug in ballingschap. Henry maakt zich zorgen of de koningin hem zal haten. Lindsay neemt de koning weg en fluistert hem over de aanstaande jacht. Queen Botwell is uitgenodigd door Queen. Mary komt bij zinnen, ziet Botvel en bekent hem zijn liefde. De botwell dwingt haar toe te geven dat ze Henry's dood wil en geeft haar haar flesje gif door te zeggen dat dit een slaappil is. Maria geeft de koning dit "medicijn", maar het gif drinkt de hans. Niets kan echter de moorddadige intrige stoppen - Botwell blaast het huis van koning Henry op. In de verte wordt het groeiende geschreeuw van de menigte gehoord. Het botvel met de koningin verbergt zich.